Анотація виконання річного плану за темою „МОДЕЛЬ-2”

За даними спектрофотометричних температурних досліджень показано, що в потрійних системах (ДНК-бромистий етидій, ДНК-профлавін у присутності конкуруючих лігандів кофеїна, хлорофіліна, флавінмононуклеотида) кофеїн проявляє як протекторні, так й інтерцепторні властивості за умови високих відносних концентрацій (концентрація кофеїна повинна бути у 10⁴ разів більше, ніж концентрація біологічно активних лігандів), хлорофілін виявляє інтерцепторні властивості – зменшує концентрацію профлавіну або бромистого етидію утворюючи стійкі гетерокомплекси з ними, а флавінмононуклеотид не виявляє конкуруючої дії.

На підставі результатів аналізу формування фрактальних текстур на поверхні плівок, які отримано з розчинів біополімерів в присутності різних іонів, запропоновано нову методику аналізу впливу біологічно активних речовин на біополімер.

Для встановлення впливу конформаційних змін сахарофосфатного кістяку ДНК на електростатичний потенціал малої борозенки виконано розрахунки його значень на підставі рішення нелінійного рівняння Пуассона-Больцмана (програмний пакет DelPhi). Показано, що електростатичні властивості вільної ДНК залежать від типу основ (сиквенс-специфічні) і від конформації сахарофосфатного кістяку. Такі структурні відмінності та пов’язані з ними зміни фізичних властивостей подвійної спіралі можуть пояснювати механізми непрямого впізнавання ДНК шляхом зміни спорідненості білків до певних послідовностей ДНК.

Проведена модернізація апаратурно-реєструючого комплексу, до складу якого входить НВЧ-діелектрометр, хвилеводні і генеруючий ланцюги та програмне забезпечення, яке дозволяє за допомогою комп’ютера реєструвати електромагнітний відгук біологічних об’єктів із застосуванням швидкого Фур’є перетворення. З використанням модернізованого комплексу проведено вимірювання діелектричної проникності еритроцитів паралельно з вимірюванням швидкості осідання еритроцитів в присутності анестетиків (артифрин, септонест та ультракаїн). Високий коефіцієнт кореляції (r=0,917) результатів за двома методиками свідчить про можливість застосування методу НВЧ-діелектрометрії для діагностики обмеженої склеродермії в клінічних умовах і про інформативність НВЧ-діелектрометрії для оцінки сенсибілізації еритроцитів до анастетиків нового покоління. Вимірювання на клітинах крові та плазмі крові проведені в ліцензованому інституті ДУ «Інститут дерматології та венерології» АМН України.

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Методом спектрофотометрії проведено температурні дослідження зв’язування у системах ДНК-бромистий етидій, ДНК-профлавін у присутності конкуруючих лігандів (флавінмононуклеотида, хлорофіліна, кофеїна). Виявлено, що кофеїн проявляє як протекторні, так й інтерцепторні властивості в потрійній системі за умови високих відносних концентрацій (концентрація кофеїна повинна бути у 10⁴ разів більше, ніж концентрація біологічно активних лігандів). Хлорофілін виявляє високі інтерцепторні властивості – утворює стійкі гетерокомплекси з лігандами, зменшуючи їх концентрацію у комплексах з ДНК. Флавінмононуклеотид не виявляє конкуруючої дії. Спектрофотометричні дослідження системи профлавін-хлорофілін показали, що величина константи гетероасоціації практично не залежить від температури, тобто ентальпія процесу дорівнює нулю.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., асп. Фомін О.В.

2. Розроблено модель для побудови теоретичних кривих теплопоглинання систем ДНК-ліганд для трьох випадків мультимодального зв’язування. Проаналізовано вигляд кривих теплопоглинання, ізотерм зв’язування та зміну концентрацій різних комплексів, що утворюються, в залежності від типу мультимодального зв’язування.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., м.н.с. Хребтова Г.С., м.н.с. Кулішенко С.Ф.

3. Методом п’єзогравиметрії отримано ізотерми гідратації плівок флавінмононуклеотида (FMN), які вирощені з нейтральних (рН = 7,0) і слабокислих (рН = 6,2) розчинів. Показано, що рівень сорбції води на плівці з нейтрального розчину вище (на ~ 30%) рівня сорбції на плівці з слабокислого розчину. Зроблено припущення, що самоасоціація ізоаллоксазінових кілець FMN зменшує доступ молекул води до центрів гідратації FMN. ІЧ-спектроскопічне дослідження плівок FMN дозволило встановити, що смуги поглинання внутрішньокільцевих коливань за участю атомів N5 і N1 зазнають частотних зсувів при зміні кислотності розчину, з якого вирощується плівка, від нейтрального (рН = 7,0) до слабокислого (рН = 6,2) значень. Але в серії експериментів, що було проведено в розчинах D₂O, таких ефектів не виявлено.

Виконавці – с.н.с. Семенов М.О., м.н.с. Блізнюк Ю.М, асп. Глибицький Д.М., інж. Мінакова Є.О.

4. Виконано аналіз вимірювань діелектричної проникності розчинів комплексів ДНК і сироваткового альбуміну бика і людини з хлорофіліном, проведених методом диференційної КВЧ діелектрометрії. Виявлена залежність зміни гідратації від наявності жирних кислот, пов’язаних з білком, при утворенні комплексів в системах білок-хлорофілін.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., с.н.с. Малєєв В.Я., н.с. Хорунжа О.В., м.н.с. Песіна Д.О.

5. Для встановлення впливу конформаційних змін сахарофосфатного кістяку ДНК на електростатичний потенціал малої борозенки виконано розрахунки його значень на підставі рішення нелінійного рівняння Пуассона-Больцмана (програмний пакет DelPhi). Показано, що електростатичні властивості вільної ДНК залежать як від типу основ (сиквенс-специфічні), так і від конформації сахарофосфатного кістяку (кута γ та конформації дезоксирибози). Також було виявлено, що однакові послідовності ДНК можуть мати різний електростатичні потенціал, і, навпаки, різні послідовності ДНК мають подібні конформації з однаковим розподілом електростатичного потенціалу в малій борозенці. Такі структурні зміни та пов’язані з ними зміни фізичних властивостей подвійної спіралі можуть пояснювати механізми непрямого впізнавання ДНК шляхом зміни спорідненості білків до певних послідовностей ДНК.

Виконавці – м.н.с. Житнікова М.Ю., с.н.с. Шестопалова Г.В.

6. Проведено дослідження впливу іонів заліза на формування текстур на поверхні плівок, які отримано з розчинів бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Показано, що на поверхні плівок БСА формуються фрактальні текстури типу «зигзаг». Зменьшення питомої довжини фрактальних текстур корелює з підвищенням концентрації іонів заліза у розчині з БСА. Проаналізована залежність в змінах УФ та фотолюмінесцентних спектрів розчинів БСА від концентрації іонів заліза, фтору, брому та хлору. Показано, що відмінності в текстурах плівок є результатом різного типу взаємодії аніонів фтору, брому та хлору з БСА. На підставі отриманих результатів запропоновано нову методику аналізу впливу біологічно активних речовин на біополімер.

Виконавці – c.н.с. Глибицький Г.М., м.н.с. Глибицький Д.М., с.н.с. Семенов М.О., с.н.с. Гасан А.Й.

7. Проведена модернізація апаратурно-реєструючого комплексу, до складу якого входить НВЧ-діелектрометр, хвилеводні та генеруючий ланцюги, а також ПК та програмне забезпечення, яке дозволяє реєструвати електромагнітний відгук біологічних об’єктів із застосуванням програми швидкого Фур’є перетворення. Модернізація апаратурно-реєструючого комплексу проведена за допомогою спеціально сконструйованого та виготовленого хвилеводного фільтру для введення терагерцевого випромінювання в вимірювальну кювету при проведенні експерементів на біологічних об’єктах. Розроблені та виготовлені елементи вимірювальних кювет для роботи в сильних магнітних полях. Модернізовано програму обробки та аналізу амплітудного формату первинного масиву даних при різних розширеннях реєстраційних файлів. Апаратурно-реєструючий комплекс не має аналогів.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., н.с. Хміль Н.В.

8. Проведено дослідження гідратації та поверхневого натягу плазми крові хворих на обмежену склеродермію в НВЧ-діапазоні радіохвиль (f = 35,6 ¸ 37,7 ГГц) в області дисперсії діелектричної проникності вільної води і зроблено розрахунки індексу реакції відносно присутності аутоантитіл до ДНК за допомогою імуноферментної тест-системи «Антитіла до ДНК – ІФА». Аналіз параметру реальної частини комплексної діелектричної проникності (e¢) показав зменшення гідратації в зразках плазми крові з більш вираженим індексом реакції ДНК_{нативна}. Проведено вимірювання діелектричної проникності еритроцитів паралельно з вимірюванням швидкості осідання еритроцитів в присутності анестетиків (артифрин, септонест та ультракаїн). Високий коефіцієнт кореляції (r = 0,917) результатів за двома методиками свідчить про можливість адаптації методу НВЧ-діелектрометрії для діагностики обмеженої склеродермії на плазмі крові в клінічних умовах і про інформативність НВЧ-діелектрометрії для оцінки сенсибілізації еритроцитів до анастетиків нового покоління. Вимірювання на клітинах крові та плазмі крові проведені в ліцензованому інституті ДУ «Інститут дерматології та венерології» АМН України.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., н.с. Хміль Н.В.

Анотація виконання річного плану за темою „МОДЕЛЬ-2”

Розроблено нову модель, що описує комплексоутворення ДНК з різними за типом біологічно активними сполуками в умовах конкурентного зв’язування для інтерпретації даних мікрокалориметрії . Для обробки даних спектрофотометричних вимірювань створено програмний модуль розрахунку параметрів гетероасоціації у системах ліганд1-ліганд2 з урахуванням самоасоціації кожного ліганду з використанням різних модифікацій генетичного алгоритму для оптимізаційного пошуку параметрів гетероасоціації лігандів.

Розроблено оригінальний метод оцінки впливу біологічно активних сполук (БАС) на біополімери. Метод базується на використанні аналізу площин, що займають текстури на плівках, які вирощені з розчинів сумішей біополімер-БАС; на наявності масштабно інваріантних фрактальных текстур на поверхні плівок та на оцінках фрактальних розмірностей текстур плівок біополімерів.

Вперше отримано результати щодо антиоксидантної дії лазерного терагерцевого випромінювання при моделюванні індукованого гемолізу, викликаного гіпотонічним розчином хлориду натрію. Встановлена можливість застосування методу НВЧ-діелектрометрії в експрес-діагностиці сенсибілізації організму до анестезуючих препаратів на прикладі дослідження молекулярної дії місцевого анестетику артифрина на клітинні структури еритроцитів.

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Отримано систему рівнянь, що описують взаємодію двох лігандів з ДНК в умовах конкурентного зв’язування. У широкому діапазоні співвідношень концентрацій лігандів та різних значеннях параметрів зв’язування побудовано теоретичні залежності зміни питомої теплоємності комплексів ДНК-ліганд1-ліганд2 від температури та розраховано термодинамічні параметри плавлення.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., м.н.с. Хребтова Г.С., асп. Фомін О.В.

2. Для обробки даних спектрофотометричних вимірювань створено програмний модуль розрахунку параметрів гетероасоціації у системах ліганд1-ліганд2 з урахуванням самоасоціації кожного ліганду. Проведено тестування різних модифікацій генетичного алгоритму для оптимізаційного пошуку параметрів гетероасоціації лігандів.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Кулішенко С.Ф., асп. Фомін О.В.

3. Методом диференційної скануючої калориметрії проведено експериментальні дослідження систем бромистий етидій – ДНК та бромистий етидій – флавінмононуклеотид – ДНК. Показано, що у розчинах з низькою іонною силою додавання флавінмононуклеотиду призводить до збільшення температури та ентальпії плавлення ДНК у потрійній системі в порівнянні з подвійною системою.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

4. Методом ІЧ спектроскопії в області поглинання карбонільних коливань проведено дослідження самоасоціації флавінмононуклеотиду в розчинах і в плівках, вирощених з нейтральних (рН=7,0) та слабокислих (рН=6,2) розчинів. У нейтральних розчинах визначено спектральні параметри карбонільних коливань: абсолютні інтенсивності, дипольні моменти та ін. В ІЧ спектрах поглинання плівок, вирощених зі слабокислих розчинів флавінмононуклеотиду, вперше виявлено нову високочастотну смугу карбонільного коливання С4=О біля 1729 см^-1. У рамках молекулярної теорії екситонів у диполь-дипольному наближенні пояснено походження цієї смуги і побудовано n-мірну модель самоасоціації флавінмононуклеотиду.

Виконавці – с.н.с. Семенов М.О., м.н.с. Близнюк Ю.М, асп. Глибицкий Д.М., інж. Мінакова Є.О.

5. Методом диференційної НВЧ діелектрометрії вивчені діелектричні параметри у мм діапазоні (λ=7,6 мм) водних розчинів сироваткового альбуміну бика (САБ) та його комплексу з хлорофіліном. На основі отриманих даних та модельних уявлень розраховано ступінь гідратації  білка та його комплексу з лігандом.  Встановлено, що процес формування комплексу супроводжується зменшенням кількості зв’язаної води в системі САБ-хлорофілін.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., с.н.с. Малєєв В.Я., н.с.Хорунжа О.В., асп. Песіна Д.О.

6. Виконано розрахунки електростатичного потенціалу фрагментів вільної ДНК з структурних баз даних. Зафіксовано залежність розподілу електростатичного потенціалу малого жолобка подвійної спіралі від послідовності нуклеотидів та типу сусідніх нуклеотидів у послідовностях.

Виконавці – м.н.с. Житнікова М.Ю., с.н.с. Шестопалова Г.В.

7. Розроблено оригінальний метод оцінки впливу біологічно активних сполук (БАС) на біополімери. Метод базується на використанні аналізу площин, що займають текстури на плівках, які вирощені з розчинів сумішей біополімер-БАС; на наявності масштабно інваріантних фрактальных текстур (МІФТ) на поверхні плівок та на оцінках фрактальних розмірностей текстур плівок біополімерів. Показано, що текстури плівок, які отримані з розчинів, що містять іони натрію, калію та рубідію, формують МІФТ на поверхні, а текстури плівок, які отримані з розчинів, що містять мутагенні іони цинку, міді та срібла відповідних концентрацій, не формують МІФТ. Подано заявку на видачу патенту «Спосіб визначення впливу речовини на біополімери».

Виконавці – c.н.с. Глибицький Г.М., м.н.с. Глибицький Д.М., с.н.с. Семенов М.О., с.н.с. Гасан А.Й.

8. Вперше отримано результати щодо антиоксидантної дії лазерного терагерцевого випромінювання при моделюванні індукованого гемолізу, викликаного 0,45 % гіпотонічним розчином хлориду натрію.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., н.с. Хміль Н.В.

9. Результати дослідження молекулярної дії місцевого анестетику артифрина на клітинні структури еритроцитів за допомогою методу НВЧ-діелектрометрії показали можливість застосування його в експрес-діагностиці сенсибілізації організму до анестезуючих препаратів.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., н.с. Хміль Н.В.

Анотація виконання річного плану за темою „МОДЕЛЬ-2”

Розроблено та проведено апробацію нової моделі комплексоутворення ДНК з різними за типом біологічно активними сполуками для інтерпретації даних мікрокалориметрії. Встановлено рівноважні константи та термодинамічні параметри зв‘язування у системах, що містять два класи біологічно активних сполук (подвійні системи) та ДНК з двома різними класами біологічно активних сполук (потрійні системи). Для подвійних систем експериментально (методи коливальної спектроскопії) виявлено міжмолекулярні водневі зв’язки, які додатково стабілізують утворення гетероасоціатів біологічно активних сполук у водному розчині. Отримані результати необхідні для побудови моделей взаємодії ДНК з біологічно активними сполуками, які є лікарськими засобами протипухлинної дії.

Удосконалення вимірювально-реєструючого комплексу для вивчення  комплексного  впливу електромагнітних хвиль мм и субмм діапазонів на біологічні об’єкти дозволило проводити дослідження згідно договору про науково-практичне співробітництво між Інститутом радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова та ДУ «Інститут дерматології та венерології АМН України» від 16 лютого 2012 року.

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Розроблено модель комплексоутворення ДНК-БАР, яка дозволяє розраховувати параметри плавлення і параметри з’вязування для досліджених систем за даними диференціальної скануючої калориметрії. Апробацію моделі проведено на системі ДНК-профлавін.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

2. Для встановлення рівноважних параметрів само- та гетероасоціаціі БАР і їх комплексоутворення з ДНК методом спектрофотометрії проведено експериментальні дослідження:

• гетероасоціації у подвійних системах БАР1-БАР2: бромистий етидій- флавінмононуклеотид, бромистий етидій – хлорофілін та профлавін – хлорофілін.
• комплексоутворення у потрійних системах ДНК-БАР1-БАР2: ДНК – бромистий етидій – флавінмононуклеотид, ДНК – бромистий етидій – хлорофілін, ДНК – профлавін – хлорофілін.

Константи само- та гетероасоціаціі, які отримані незалежно в однакових експериментальних умовах, необхідні для розрахунку параметрів комплексоутворення в системі БАР1-БАР2-ДНК.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

3. Методами ІЧ та КР спектроскопії досліджено утворення гетерокомплексів біологічно активних речовин: флавінмононуклеотиду (FMN), бромистого етидія (EB), профлавіну (PRF), теофіліну (TPH) і кофеїну (CAF) у нейтральних водних розчинах. Аналіз ІЧ та КР спектрів показав утворення міжмолекулярних водневих зв’язків між функціональними атомними групами (С=О та NH₂) у гетерокомплексах FMN-EB, FMN-PRF і TPH-EB. Виявлені зміщення частот коливань карбонільних груп в ІЧ спектрах дозволили оцінити величину ентальпії водневих зв’язків. Показано, що міжмолекулярні водневі зв’язки додатково стабілізують стопочні структури досліджуваних гетерокомплексів.

Виконавці – с.н.с. Семенов М.О., м.н.с. Близнюк Ю.М.

4. Методом диференційної НВЧ діелектрометрії у мм діапазоні (λ=7,6 мм) проведено дослідження діелектричних параметрів водних розчинів хлорофіліну, сироваткового альбуміну людини та його комплексу з хлорофіліном. Виконано аналіз експериментальних результатів, які отримані методом діелектрометрії для розчинів сироватковий альбумін – хлорофілін. На підставі модельних уявлень розраховано ступінь гідратації хлорофиліну, сироваткового альбуміну людини та їх комплексу.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В., асп. Песіна Д.О.

5. Досліджено самоорганизаціюДНК при дегідратації в присутності іонів Na⁺ і Ag⁺ та наночасток срібла. Показано, що характер утворення дендритних текстур, який визначається за розміром площин таких структур на поверхні плівки дегідратованої ДНК, залежить від конформаційного стану ДНК та корелює з мутагенними властивостями доданих сполук.

Виконавці – н.с. Глибицький Г.М., м.н.с. Глибицький Д.М., с.н.с. Семенов М.О.

6. Закінчено розробку та модернізацію програмного забезпечення для реєстрації взаємодії елементів крові з міліметровим випромінюванням. Дискретизація спектру вимірювального треку в діапазоні від 0 до 96000 Гц становить не гірше 0,17 Гц. Модернізація програмного забезпечення дозволила проводити розрахунки уявної частини діелектричної проникності з урахуванням значного поглинання форменими елементами крові в 8-мм діапазоні радіохвиль.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., н.с. Хміль Н.В.

7. Проведено удосконалення хвилеводної частини вимірювально-реєструючого комплексу з додатковим введенням циркуляторів для проведення досліджень, пов’язаних з пошуком резонансних частот еритроцитів, плазми крові, мікроводоростей та інших біооб’єктів.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., н.с. Хміль Н.В.

Анотація виконання річного плану за НДР «МОДЕЛЬ» (2007-2011рр.).

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Методами спектрофотометрії та диференційної скануючої калориметрії досліджено комплексоутворення в системі актиноцинове похідне Act II – salmon testes ДНК при різних співвідношеннях концентрацій ДНК та ліганду. Отримано величини місць зв’язування, констант зв’язування та енергетичні параметри зв’язування Act II з salmon testes ДНК.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

2. Для аналізу даних спектрофотометричного титрування побудовано нову систему багатопоточної паралельної оптимізації спектрів поглинання БАР з використанням генетичних алгоритмів. Тестування нової програми оптимізації проведено на системах ліганд1-ліганд1, ліганд1-ліганд2. Розраховано константи само- та гетероасоціації для сумішей лігандів: профлавіну, бромистого етидію, похідного актиноцину, флавінмононуклеотиду.

Виконавці – с.н.с. Духопельников Є.В., м.н.с. Кулішенко С.Ф.

3. Методом диференційної НВЧ діелектрометрії вивчені діелектричні властивості водних розчинів хлорофіліну та комплексу ДНК-хлорофілін. Знайдено, що процес комплексоутворення супроводжується зміною діелектричних властивостей розчину, що обумовлено змінами у водній оболонці нуклеїнової кислоти. На основі отриманих даних та модельних уявлень розраховано ступінь гідратації ліганду та його комплексу з ДНК. Встановлено, що процес формування комплексу супроводжується зменшенням кількості зв’язаної води в системі ДНК-хлорофілін.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В., асп. Песіна Д.О.

4. Показано, що в плівках, які отримано з розчинів ДНК та солей лужних і/або лужноземельних металів, реєструються текстури. Текстури мають структуру, яка притаманна формам рідких кристалів. Співвідношення між площиною текстури на плівці і площиною всієї плівки залежить від властивостей іонів, які додавали у розчин, та від співвідношення концентрацій солей металів і ДНК у розчині. Більшість текстур, які утворюються у плівках, що містять ДНК і солі різних металів, є текстурами фрактального типу, величини фрактальної розмірності яких можуть використовуватися для попередньої оцінки рівня мутагенності біологічно активних речовин in vitro.

Виконавці – н.с. Глибицький Г.М., м.н.с. Глибицький Д.М., с.н.с. Малєєв В.Я.

5. За даними ІЧ-спектроскопічних досліджень показано, що присутність наночасток срібла у плівках ДНК призводить до денатурації ДНК. Зміни, які спостерігаються у ІЧ-спектрах, свідчать про розрив водневих зв‘язків, що утворюються у нативній ДНК за участю груп сахарофосфатного кістяку. Ці результати підтверджують припущення, що формування текстур на поверхні плівок визначається ступенем нативності ДНК.

Виконавці – н.с. Глибицький Г.М., м.н.с. Глибицький Д.М., с.н.с. Семенов М.О.

6. Проведено дослідження механізмів конкурентного зв’язування в потрійній системі профлавін-ДНК-кофеїн у широкому інтервалі відносних концентрацій ДНК/ліганд1, ліганд2. Показано, що у потрійній системі кофеїн проявляє і інтерцепторний, і протекторний механізми.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., н.с. Гладковська Н.О., в. інж. Мінакова Є.О.

7. Виконано дослідження розподілу нуклеотидів з альтернативними конформаціями нуклесомної ДНК за даними статистичного аналізу 14 корових часток нуклеосом з PDB бази даних.

Виконавці – м.н.с. Житнікова М.Ю. с.н.с. Шестопалова Г.В.

Анотація виконання річного плану за НДР «БУКСИР» (2007-2011рр.)

1. Проведено вимірювання реакції нативних клітин при синхронні дії випромінювання від HCN-лазера, а також джерела мм-діапазону радіохвиль з метою дослідження та пошуку резонансної взаємодії. Вимірювання та контроль комплексної дії радіохвиль НВЧ та терагерцевого діапазонів були проведені за допомогою НВЧ комплексу потужністю 20 мВт (частоти 35 ГГц – 37,7 ГГц) та терагерцевого комплексу потужністю 10 мВт (частоти 1,0 ТГц – 2,0 ТГц). Вимірювання були проведені за допомогою установки «Установка для дослідження біологічних об’єктів хвилеводними методами в НВЧ-діапазоні».
2. При моделюванні осмотичного гемолізу суспензії еритроцитів показано антиоксидантний ефект терагерцевого випромінювання; при цьому було зареєстровано суттєве збільшення резистентності мембрани еритроцитів до гемолізуючого агенту (0,45% сольового розчину NaCl) при терагерцевій лазерній експозиції (f = 0,89 ТГц, P = 1,5 мВт/см², час опромінення 60 хвилин).
3. Показана можливість моделювати сонячну активність в лабораторних умовах терагерцевим лазерним випромінюванням. Зареєстровано кореляцію між числом сонячних плям та гідратацією суспензії одноклітинних водоростей. Показано, що терагерцеве випромінювання (f = 0,89 ТГц, P = 1,5 мВт/см²) належить до «альгофільних» частот електромагнітного спектру.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., м.н.с. Древаль Н.В.

Анотація виконання річного плану за НДР „МОДЕЛЬ” (2007-2011рр.)

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Методами спектрофотометрії (СФ) та диференціальної скануючої калориметрії (ДСК) проведено дослідження комплексоутворення в системі профлавін – salmon testes ДНК. Показано, що у залежності від співвідношення їх концентрацій утворюються два типи комплексів, які відрізняються за термодинамічним станом ДНК. Розраховано параметри зв’язування профлавіну з ДНК за типом інтеркаляції. Константи, які розраховано за допомогою методів СФ та ДСК, мають близькі значення.

Методами спектрофотометрії, флуоресцентної спектроскопії та диференціальної скануючої калориметрії досліджено взаємодію флавінмононуклеотиду (ФМН) з salmon testes ДНК. Показано, що ФМН майже не зв’язується з ДНК (К=50 М^-1) та не впливає на термодинамічні параметри плавлення ДНК. Зроблено висновок, що у потрійних системах ФМН-ліганд-ДНК флавінмононуклеотид не може регулювати зміну біологічного ефекту ліганду за протекторним механізмом.

Виконавці –с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

2. За допомогою методу абсорбційної спектрофотометрії досліджено конкурентне зв’язування акридинового мутагену ICR-191 та метилксантинів з ДНК із тимусу теляти. Проведено спектрофотометричне дослідження взаємодії акридинового мутагену ICR-191 з кофеїном та теофіліном. Показано, шо ICR -191 взаємодіє з кофеїном з більшою константою зв’язування (К=1461±95 М^-1), ніж з теофиліном (К=404±29 М^-1). Проведено спектрофотометричне дослідження конкурентного зв’язування ICR -191 та метилксантинів (кофеїну та теофіліну) з ДНК із тимусу теляти. Встановлено, що кофеїн здійснює більший вплив на взаємодію ICR-191 з ДНК, ніж теофілін. Кофеїн впливає на зв’язування акридинового мутагену з ДНК, починаючи з невеликих концентрацій ДНК, коли у розчині багато вільних лігандів. Натомість вплив теофіліну відчутний тільки при великих концентраціях ДНК, коли теофілін починає зв’язуватися з ДНК

Виконавці – н.с. Єрмак Є.Л.

3. В НВЧ діапазоні вивчені діелектричні властивості водного розчину броміду етидія і комплексу ДНК з етидієм. Для броміду етидія на основі отриманих даних визначені ступінь гідратації та імовірні гідратно–активні центри. Знайдено, що процес комплексоутворення супроводжується певною зміною діелектричних властивостей розчину, що може вказувати на тенденцію до зростання кількості зв’язаної води при утворенні комплексу. Порівняння з літературними даними і аналіз за допомогою моделей взаємодії ДНК з інтеркаляторами показав, що зростання гідратації може бути обумовлено процесами розкручування і подовження ДНК, що відбуваються при інтеркаляції.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В.

4. Порівняльний аналіз діелектричних властивостей водних розчинів комплексів інтеркаляторів ActII, профлавіну, броміду етидія та йодиду пропідія з ДНК показав, що для всіх вивчених комплексів ДНК-інтеркалятор відбувається зменшення діелектричної проникності, яке, як показав розрахунок, відповідає збільшенню гідратації ДНК на декілька молекул води (у перерахунку на нуклеотид).

Виконавці –с.н.с. Малєєв В.Я.

5. Методом спектрофотометричного титрування проведено дослідження взаємодії бромистого етидію з тимусною ДНК в межах широкого діапазону концентрацій одновалентних іонів Na⁺ (від 7.5×10^-4 до 2 М) з використанням трьох теоретичних моделей. Найбільш оптимальною визнано модель, згідно якої ліганди утворюють комплекси, що відрізняються за типом інтеркаляції: моноінтеркальований ліганд та ліганди на сусідніх місцях зв’язування. Іони враховувались як конкуренти ліганду по інтеркаляційному типу комплексу. За допомогою цієї моделі оцінено вплив одновалентних іонів Na⁺ на параметри комплексоутворення бромистого етидію з тимусною ДНК та отримано залежності логарифмів констант зв’язування від логарифму концентрацій NaCl. За допомогою цих залежностей розраховано вклад поліелектролітної енергії в повну вільну енергію взаємодії ліганду з ДНК.

Виконавці –с.н.с. Круглова О.Б, в. інж. Мінакова Є.О.

6. Виконано дослідження конформаційних змін сахарофосфатного кістяку ДНК у складі нуклеосом на підставі статистичного аналізу 14 корових часток нуклеосом з PDB бази даних. Встановлено, що більш ніж 8% нуклеотидів у складі нуклеосомальної ДНК мають альтернативні t і g− конформації кута γ сахарофосфатного кістяку. Виявлено залежність таких переходів від нуклеотидного складу. Показано також, що зміна конформації кута g призводить до зміни геометрії та електростатичного потенціалу поверхні подвійної спіралі ДНК. Такі перебудови є важливими для навиття ДНК на гистоновий кор нуклеосом та реалізаціїї непрямого механізму впізнавання білками специфічних сайтів зв¢язування на ДНК.

Виконавці – асп. Ткаченко М.Ю., н.с. Борискіна О.П., с.н.с. Шестопалова Г.В.

7. Розроблено та виготовлено робочу кювету для проведення вимірювань діелектричних параметрів розчинів біологічних речовин у діапазоні частот від 30 дo 40 GHz при різних температурах (від 0 дo 70°С). Проведено вимірювання діелектричних параметрів розчинів сахарози при різних температурах та концентраціях і розраховано енергію активації дипольної релаксації при різних температурах.

Виконавці – н.с. Глибицький Г.М.

Анотація виконання річного плану за НДР «БУКСИР» (2007-2011рр).

Проведено дослідження електромагнітного відгуку біологічних об’єктів при комбінованому впливі електромагнітних хвиль міліметрового (мм, f = 35,5 ¸ 37,7 ГГЦ) та терагерцевого (ТГц, f = 0,89 ТГц) діапазонів. Об’єктами дослідження були суспензія еритроцитів та одноклітинні водорості – зразки з водоймищ Харківської області та чисті культури.

• В експериментах на еритроцитах вивчено вплив електромагнітних хвиль ТГц діапазону на перекісне окислювання ліпідів та на осмотичну резистентність еритроцитів з різними морфо-функціональними порушеннями. Показано позитивний вплив ТГц випромінювання на осмотичну резистентність еритроцитів, які зазнавали дію осмотичного гемолізу в присутності сольового розчину NaCl (0,45 %), при експозиції 30 хвилин. При цьому резистентність мембрани еритроцитів підвищувалась майже в 2 рази, а рівень продуктів пероксидації практично не змінювався.

Практичне значення: Вибрані та досліджені режими опромінення можуть бути запропоновані для практичної медицини в терапії хронічних алергодерматозів, патогенез більшості яких пов’язаний з порушенням нормального розташування мембранного біслоя та з ушкодженням мембрано-зв’язаних білків, що є причиною інактивації мембранних рецепторних комплексів, а також систем транспорту води та іонів через мембрану еритроцитів.

• В експериментах на одноклітинних водоростях досліджувався електромагнітний відгук мікроводоростей в аспекті параметрів сонячної активності, який реєструвався в міліметровому діапазоні довжин хвиль при активації суспензії клітин випромінюванням терагерцевого діапазону. Було показано зв’язок між дійсною частиною комплексної діелектричної проникності (e¢) та кількістю сонячних плям (sunspots number), які характеризують рівень сонячної активності, при цьому коефіцієнт кореляції (r) склав -0,71.

Практичне значення: Показано можливість прогнозувати продуктивність верхнього шару екваторій в залежності від сонячної активності.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., м.н.с. Древаль Н.В.

Анотація виконання річного плану за НДР „МОДЕЛЬ” (2007-2011рр.)

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Методами флюоресценції та спектроскопіі досліджено взаємодію профлавіну (Pf) з матрицями рolyA-polyU, polyG-polyC та ДНК з тимусу теляти. За експериментальними даними спектрофотометричного та люмінесцентного титрування побудовано ізотерми Скетчарда для всіх досліджених систем і отримано величини констант і місць зв’язування. З найбільшою константою Pf зв’язується з природною ДНК і з синтетичним полірибонуклеотидом polyА-polyU. Спільне використання двох оптичних методів дозволило визначити можливість формування трьох типів комплексів у системі Pf – ДНК і тільки одного типу комплексів у системах Pf – polyА-polyU та Pf – polyG–polyC. Відсутність комплексів за зовнішнім типом в системах Pf – polyA–polyU і Pf – polyG–polyC пов’язана з тим, що полірибонуклеотиди мають А-форму подвійної спіралі.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

2. Методом молекулярного докінгу отримано комплекси профлавину (Pf) з фрагментами гомополімерів ДНК і РНК різного нуклеотидного складу за типом інтеркаляції та зв¢язування у борозенках подвійних спіралей. Показано, що Pf може утворювати два типа інтеркаляційних комплексів з нуклеїновими кислотами, які практично не відрізняються за енергіями взаємодії. Встановлено лише незначну перевагу при зв¢язуванні Pf з GC-послідовностями. При взаємодії Pf і В-ДНК утворюються комплекси у малій борозенці спіралі з максимальною енергією зв¢язування для АТ-послідовностей. З А-формою РНК та ДНК комплекси утворюються при зв¢язуванні Pf у великій борозенці, але такі комплекси енергетично менш вигідні, ніж інтеркаляційні і для них не знайдено залежності енергії зв¢язування від послідовності. Для усіх типів комплексів показано можливість формування водневих зв¢язків між NH₂-групами Pf та атомами цукрово-фосфатного кістяку нуклеїнових кислот при зв¢язуванні Pf по типу інтеркаляції та атомами основ при зв¢язуванні Pf у борозенках спіралей.

Виконавці – с.н.с. Шестопалова Г.В., м.н.с. Мірошніченко К.В., інж. Суханов О.С.

3. Методом спектрофотометричного титрування проведено дослідження взаємодії похідного актиноцину з тимусною ДНК в широкому діапазоні концентрацій одновалентних іонів Na⁺ та К⁺. Запропоновано нову модель зв’язування лігандів та ДНК з урахуванням іонів як прямих конкурентів ліганду за інтеркаляційним типом комплексу, і непрямих конкурентів при зовнішньому зв’язуванні ліганду на матриці ДНК. За допомогою цієї моделі оцінено вплив одновалентних іонів Na⁺ та К⁺ на константи комплексоутворення за обома типами зв’язування та розраховано вклад поліелектролітної енергії в повну вільну енергію взаємодії ліганда з ДНК в залежності від типу іонів.

Виконавці –с.н.с. Круглова О.Б, асп. Мінакова Є.О.

4. Методами ІЧ-спектроскопії та п’єзогравіметрії проведено дослідження формування комплексів ДНК з вітаміном В₂ (рибофлавін, РБФ) при співвідношенні P/D=8. За допомогою ізотерм гідратації з’ясовано, що утворення комплексу ДНК-РБФ призводить до зниження гідратації ДНК. Тобто ліганд зв’язується з гідратно активними центрами ДНК, перешкоджаючи їх зв’язуванню з водою. За даними ІЧ-спектроскопії встановлено, що при утворенні комплексів ДНК з рибофлавіном приймають участь фосфатні групи ДНК та кисневий атом рибозного кільця.

Виконавці – м.н.с. Близнюк Ю.М., с.н.с. Больбух Т.В., с.н.с. Гасан А.Й., с.н.с. Семенов М.О.

5. За допомогою метода диференційної НВЧ діелектрометрії в міліметровому діапазоні хвиль одержані діелектричні характеристики водних розчинів йодистого пропідію та комплексів пропідію з ДНК. На основі моделі гідратації розраховано ступінь гідратації. Показано, що стабілізація комплексу ДНК – пропідій обумовлена не тільки взаємодією між компонентами, але й взаємодією з оточуючою зв’язаною водою, що характеризується появою при комплексоутворенні додаткових молекул води в гідратній оболонці ДНК.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В.

6. Проведено дослідження ролі конформаційних переходів цукрово-фосфатного кістяку ДНК у механізмах непрямого впізнавання білками цільових ділянок ДНК. Зроблено статистичний аналіз конформаційних параметрів цукрово-фосфатного кістяку та площі доступної поверхні нуклеотидів у малій та великій борозенках фрагментів ДНК з 218 білково-нуклеїнових комплексів. Показано, що частота переходу в альтернативні конформації різних нуклеотидів неоднакова. Визначено також, що перехід цукрово-фосфатного кістяку ДНК з класичної конформації в альтернативні призводить до характерних змін площі полярної та неполярної доступної поверхні ДНК у малій та великій борозенках для нуклеотидів з А- та В-подібною конформацією дезоксирибози, зокрема робить полярні атоми О3′ та О5′ більш доступними для взаємодії з позитивно зарядженими амінокислотними залишками. Виявлено індивідуальні особливості полярно-неполярного профілю різних нуклеотидів у однаковій конформації. Результати, що було отримано, вказують на важливу роль конформаційних переходів ДНК для білково-нуклеїнових взаємодій та розширюють уявлення про молекулярні механізми непрямого впізнавання.

Виконавці – асп. Ткаченко М.Ю., н.с. Борискіна О.П., с.н.с. Шестопалова Г.В.

Анотація виконання річного плану за НДР «БУКСИР» (2007-2011рр).

1. Продовжено аналіз електромагнітного відгуку білкових макромолекул цілісної біологічної системи на клітинах та плазмі крові донорів при комбінованому впливі випромінювання мм та субмм діапазонів шляхом скринінгу частот модуляції лазерного та міліметрового випромінювання. Проведено пошук резонансної частоти макромолекулярних комплексів сперміїв бугаїв-плідників з модульованим по амплітуді низькоінтенсивним електромагнітним випромінюванням терагерцового діапазону. За допомогою акустичного аналізу щодо п’єзоелектричної взаємодії суспензії сперміїв показано, що частота вібрації хвостової частини сперміїв бугаїв може служити індикатором якості еякуляту для біотехнології кріоконсервації та штучного осіменіння.

Виконавці – с.н.с. Колесніков В. Г., м.н.с. Древаль Н.В.

Анотація виконання річного плану за НДР „МОДЕЛЬ” (2007-2011рр.)

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Методами диференційної скануючої калориметрії (ДСК) та спектрофотометрії досліджено взаємодію профлавіну (Pf) з тимусною ДНК. Показано, що профлавін утворює на матриці ДНК як мінімум 3 типи комплексів. При високих значеннях співвідношення концентрацій ДНК та ліганду (P/D) утворюється два комплекси по типу інтеркаляції. В першу чергу Pf інтеркалює в GC пари. При низьких значеннях P/D Pf взаємодіє з ДНК по типу зовнішнього зв’язування. Зі спектрофотометричних концентраційних залежностей розраховано параметри комплексоутворення Pf з ДНК. За допомогою методу ДСК отримано термодинамічні параметри плавлення ДНК у складі цих комплексів.

Виконавці –с.н.с. Круглова О.Б., с.н.с. Березняк К.Г., н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., асп. Хребтова Г.С.

2. Методами спектроскопії комбінаційного розсіяння світла та спектрофотометрії у видимій області досліджено особливості комплексоутворення бромистого етидия (ЕБ) з тимусною ДНК при високих та низьких співвідношеннях концентрацій біополімер/ліганд. Показано, що зв’язування ЕБ з ДНК здійснюється за типом інтеркаляції та зовнішнього зв’язування. З аналізу спектрів комбінаційного розсіяння комплексів встановлено, що аміногрупи ЕБ формують водневі зв’язки з акцепторними групами атомів полінуклеотидної матриці ДНК в обох типах комплексів. Низька ступінь заповнення ДНК лігандом не змінює В-форму ДНК, а висока призводить до конформаційного В-А переходу.

Виконавці – м.н.с. Близнюк Ю.М., с.н.с. Больбух Т.В., с.н.с. Гасан А.Й., с.н.с. Семенов М.О., м.н.с. Филипський А.В.

3. За допомогою методу диференційної НВЧ діелектрометрії знайдені діелектричні параметри водних розчинів профлавіну, мірицетину, комплексів ДНК – профлавін і ДНК – мірицетин. На основі отриманих даних визначений і проаналізований стан гідратної оболонки досліджених речовин. Показано, що зміни у гідратації при комплексоутворенні ДНК з профлавіном і мірицетином дають суттєвий внесок у стабілізацію комплексів.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В.

4. Розглянуто три моделі побудови інтеркаляційного сайту на молекулі-мішені – ДНК, які враховують особливості вбудови різних за структурою інтеркаляторів: етидію броміду, дауноміцину та 9-аміно-ДАКА. За допомогою молекулярного моделювання методами молекулярного докінгу та молекулярної механіки з неявним урахуванням розчинника показано, що при побудові інтеркаляційної мішені достатньо урахувати тільки найбільш суттєве розкручування подвійною спіралі ДНК в інтеркаляційному сайті (для етидія та 9-аміно-ДАКА) або у сусідній парі (парах) основ (для дауноміцину). Зафіксовано також конформаційні перебудови сахарів та асиметрія їх конформацій біля сайту інтеркаляції. Виявлено вплив послідовності основ ДНК на загальний сумарний кут розкручування ДНК-мішені.

Виконавці – с.н.с. Шестопалова Г.В., м.н.с. Мірошніченко К.В., інж. Суханов О.С.

5. Створено базу даних ProtNA-ASA, доступ до якої в Інтернеті є вільним (www.protna.bio-page.org). База даних містить систематизовану інформацію про конформаційні параметри та площі доступної поверхні атомів нуклеїнових кислот у складі білково-нуклеїнових комплексів. Інформація з бази даних ProtNA-ASA дозволяє виконувати статистичний порівняльний аналіз структури вільної ДНК та ДНК у комплексах з білками. Такий аналіз суттєво розширює уявлення про молекулярні механізми непрямого білково-нуклеїнового впізнавання.

Виконавці – асп. Ткаченко М.Ю., н.с. Борискіна О.П., с.н.с. Шестопалова Г.В.

Анотація виконання річного плану за НДР „МОДЕЛЬ” (2007-2011рр.)

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Проведено спектрофотометричне дослідження зв’язування теофіліну з тимусною ДНК в присутності конкуруючих лігандів. В якості конкуруючих лігандів були обрані сполуки, що поглинають у видимій області спектру та взаємодіють з ДНК з утворенням різних типів комплексів – похідне актиноцину ActII та бромистий етидій. Показано, що константи зв’язування теофіліну з ActII (943±124 М^-1) та бромистим етидієм (177±36 М^-1) значно більші, ніж кофеїну в комплексах з тими ж лігандами. За допомогою програм оптимізації спектрофотометричних концентраційних залежностей DALSCOMP та COMPHET отримані константа (185±20 М^-1) та величина місця зв’язування (n=1) теофіліну з ДНК. На основі проведених досліджень зроблено висновок про більшу активність теофіліну ніж кофеїну як акцептора ароматичних молекул лігандів у розчині. Це необхідно враховувати при одночасному використанні цих лікарських препаратів в медицині та біології. Комплекс програм по обробці експериментальних даних має застосування при вивченні конкурентного зв¢язування різних типів лікарських сполук, які взаємодіють з ДНК. Отримані результати можуть бути використані для рекомендацій при застосуванні комбінованої хіміотерапії.

Виконавці – н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Єрмак Є.Л., асп. Мінакова Є.О., с.н.с. Круглова О.Б.

2. Методом ДСК проведено дослідження впливу похідного актиноцину ActIII на термодинамічні параметри плавлення salmon testes ДНК. Запропоновано методи розрахунку термодинамічних параметрів зв’язування лігандів з ДНК за даними ДСК. Показано, що при використанні моделі, яка заснована на рівняннях хімічних рівноваг, необхідно враховувати розмір кооперативної одиниці плавлення ДНК, величину місця зв’язування ліганду та залежність константи зв’язування від температури. Уточнення, що були внесені до традиційної моделі розрахунку термодинамічних параметрів взаємодії лігандів з ДНК за даними ДСК, дозволяють більш коректно обчислювати такі параметри при мультимодальному зв¢язуванні лігандів.

Виконавці – с.н.с. Круглова О.Б., с.н.с. Березняк К.Г., н.с. Духопельников Є.В., н.с. Гладковська Н.О., м.н.с. Хребтова Г.С.

3. Проведено дослідження впливу послідовності на структуру та динаміку додекамерів нуклеїнових кислот за допомогою методу молекулярно-динамічного моделювання. Створено базу молекулярно-динамічних траєкторій додекамерів ДНК, що можуть бути використані в якості мішеней для біологічно активних сполук. Методом гнучкого докінгу були отримані найбільш імовірні комплекси похідного протипухлинного антибіотика актиноміцину D з несиметричними боковими ланцюгами (АctIII-II) та фрагментів ДНК різної послідовності для зв’язування за типом інтеркаляції та зв’язування в борозенках подвійної спіралі ДНК. Отримані результати дозволять моделювати молекулярні комплекси аналогів протипухлинних антибіотиків з різними за нуклеотидним складом сайтами зв¢язування ДНК.

Виконавці – м.н.с. Мірошніченко К.В., с.н.с. Шестопалова Г.В.

4. З використанням теорії молекулярних екситонів та ІЧ спектрів поглинання двониткових полінуклеотидів poly(rА)-poly(rU), poly(rG)-poly(rC) та poly(dA)-poly(dT), що були отримані раніше, у диполь-дипольному наближенні проведений розрахунок резонансних взаємодій валентних карбонільних (С=О) та внутрішнокільцевих (C=N) коливань азотистих основ. На основі зроблених розрахунків досліджено рухливість азотистих основ у процесі структурних перебудов полінуклеотидів, що викликані гідратацією. Показано, що в сухому стані двониткові полінуклеотиди знаходяться у формі, що незначною мірою відрізняється від двоспірального стану. Отримані результати дозволяють описати молекулярні механізми динаміки азотистих основ при структурних перебудовах ДНК.

Виконавці – с.н.с. Семенов М.О., н.с. Борискіна О.П., с.н.с. Малєєв В.Я.

Анотація виконання річного плану за НДР «СПІРАЛЬ» (2004-2006 рр.)

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Проведено детальні спектрофотометричні дослідження зв’язування бромистого етидія (ЕБ) з ДНК. Встановлено, що він утворює з ДНК як мінімум два типи комплексів, для яких розраховано молярні коефіцієнти екстинкції, константи і величини місць зв’язування. Показано, що зв’язування ЕБ з ДНК при високих заповненнях матриці призводить до змін структури ДНК.

Проведено спектрофотометричне дослідження конкурентного зв’язування цитозину та його аналогів з ДНК у присутності ЕБ. Показано, що немодифіковані цитидинові аналоги (цитидин і AraС) не конкурують з ЕБ за місця зв’язування на ДНК, але призводять до змін ходу кривих титрування ЕБ. При зв’язуванні цитидина і AraС з ДНК взаємодія може відбуватися по тим групам основ ДНК, що не беруть участь у зв’язуванні з ЕБ, тому вони не є безпосередніми конкурентами ЕБ, але створюють стеричні перешкоди для його зв’язування з ДНК. Модифіковані цитидинові аналоги (6AZC, AZAfur і AZAxyl), що мають активну азагрупу в цитозиновому кільці, конкурують з ЕБ за місця зв’язування на ДНК по типу інтеркаляції. Визначено константи зв’язування 6AZC, AZAfur і AZAxyl з ДНК. Величина місця зв’язування 6AZC, AZAfur і AZAxyl з ДНК порядку однієї основи на молекулу ліганду, що свідчить про відсутність АТ-, GC- специфічності цих лігандів. У взаємодії 6AZC, AZAfur і AZAxyl з ДНК можуть бути задіяні азагрупи нуклеозидів і аміногрупи основ ДНК.

Виконавці – с.н.с. Круглова О.Б., н.с. Гладковська Н.О., асп. Єрмак Є.Л., асп. Мінакова Є.О.

2. Методом Монте Карло виконано комп’ютерне моделювання взаємодії фрагментів ДНК та похідного актиноцину (ActIІ) при співвідношенні ліганд – мішень 1:1 та 2:1 з урахуванням водного оточення. Отримано низькоенергетичні структури комплексів, що становлять найбільш вірогідні молекулярні моделі двох типів комплексів – зв’язування ActIІ у малому жолобі та інтеркаляція ActIІ у GC-сайт. Розраховано енергетичні та структурні параметри комплексів. Показано, що молекули води вносять додаткову стабілізацію за рахунок утворення водних мостиків між донорно-акцепторними групами фрагментів ДНК та лігандів. Визначено можливі розміри місць зв’язування ActIІ у малому жолобі, які дорівнюють 3-4 парам основ на молекулу ліганду. При інтеркаляції молекул ActII в GC-сайт розміри місць зв’язування мають бути більше 4 пар основ на молекулу ліганду.

Виконавці – с.н.с. Шестопалова Г.В.

3. За допомогою методу комбінаційного розсіювання було досліджено особливості комплексоутворення з ДНК актиноцинових похідних з різною довжиною бічних ланцюгів, а також похідного, що відрізняється побудовою кінцевих груп, в яких метильні групи третинних амінів замінено атомами водню. Усі Раман спектри було отримано для сумішей ліганд-ДНК, в яких переважає кожен з можливих типів комплексів: при P/D10 – більша кількість комплексів II типу (інтеркаляція).

На підставі літературних даних щодо нормальних коливань феноксазонового хромофору та характеристичності Раман смуг і виконаних нами раніш Раман спектроскопічних досліджень похідних актиноцину в вільному стані та в комплексі з різними полінуклеотидними матрицями було зроблено віднесення частот Раман спектрів основних функціональних груп лігандів. Методом Раман спектроскопії було визначено основні групи атомів актиноцинових похідних, які беруть участь в утворенні різних типів комплексів (інтеркаляція та зовнішнє зв’язування) з полінуклеотидними матрицями.

Виконавці – с.н.с. Больбух Т.В., м.н.с. Близнюк Ю.М., с.н.с. Круглова О.Б., с.н.с. Семенов М.О.

4. Методом диференційної НВЧ діелектрометрії отримані значення комплексної діелектричної проникності комплексу ДНК – спермін в нативному і підданому гама опроміненню станах. Показано, що сумарний ступень гідратація комплексу є сумою ступенів гідратацій компонент. Кількість зв’язаної води залишається незмінною після опромінення, що вказує на відсутність істотних пострадіаційних змін у гідратній оболонці ДНК і збереженні основних елементів її структури. Методом електрофореза знайдено, що радіаційний вплив приводить до фрагментації ДНК як у складі комплексу зі сперміном, так і у відсутності ліганду. Але у першому випадку діапазон довжин фрагментів значно менше, що говорить про перехоплювання продуктів радіолізу води і свідчить про частковий захист структури ДНК від ушкоджень.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В., с.н.с Красницька А.А.

5. Отримано Раман спектри політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу в розчинах оксиду дейтерію. Частоти валентних карбонільних коливань типу А, які призводять до появи смуг у Раман спектрі, розраховані згідно з моделлю слабо зв’язаних осциляторів, у рамках теорії збурень для поліпептидних структур з врахуванням динамічних резонансних взаємодій диполів переходу. Розраховані частоти добре узгоджуються з експериментальними частотами смуги Амід I в Раман спектрах. На основі розрахунків зроблені віднесення частот компонент смуги Амід I в експериментальних Раман спектрах водних розчинів політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу.

За допомогою метода п’єзогравіметрії було отримано ізотерми гідратації тонких плівок poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу. На підставі моделі адсорбції води Д’Арсі і Ватта отримано кількісні характеристики внутрішнього та зовнішнього шарів гідратної оболонки досліджуваних молекул, що мають структуру потрійної спіралі, та розраховано теплоти сорбції води у шарах Ленгмюра, Генрі та мультишарі. Значення повної ентальпії гідратації для poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу складають відповідно –10.9 and –12.2 кДж/моль фрагменту – Gly-X-Y-. З урахуванням енергетичних характеристик гідратації poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу, а також отриманих раніше кількісних оцінок прямих ентальпії пептид-пептидних водневих зв’язків у колагенових білках, зроблені оцінки відносних внесків енергій різних типів взаємодій в загальну енергію стабілізації триспіральних структур колагенового типу.

Виконавці – м.н.с. Мележик О.П., с.н.с. Больбух Т.В., с.н.с. Семенов М.О.

Анотація виконання річного плану за НДР «Структура»

1. Методами диференційної скануючої мікрокалоріметрії, спектрофотометрії у видимій та ультрафіолетовій областях виконано дослідження взаємодії похідного актиноцину ActІІІ з одно- та двоспіральною poly(rС). Розраховано параметри комплексоутворення ActІІІ з poly(rС). Визначено, що взаємодія похідного актиноцину ActІІІ з poly(rС) призводить до зменшення температури, ентальпії та ентропії плавлення poly(rС) у порівнянні з вільним полінуклеотидом. Показано, що основною причиною зменшення термодинамічних параметрів плавлення poly(rС) є конформаційні зміни матриці, викликані взаємодією з лігандом Act ІІІ.

Проведено молекулярно-динамічне моделювання різних спіральних форм poly(rС) в пакеті AMBER 8 з явним урахуванням іон-гідратного оточення. Отримано молекулярно-динамічні траєкторії для односпіральної poly(rС) (довжина фрагменту – 10 цитозинів) та двох топологій (5’Е та 3’Е) чотириспіральної poly(rС) (довжина фрагментів – два двоспіральних фрагмента по 5 пар нуклеотидів). Структура двоспіральної poly(rС) для відносно коротких фрагментів (12, 24 та 48 пар цитозинів) виявилась нестабільною і зруйнувалася в процесі моделювання. Проведено аналіз отриманих траєкторій за допомогою методу істотної динаміки, та зроблено оцінки внутрішньомолекулярних ентропій в квазігармонічному наближенні. Виявлено, що зі спіральних форм poly(rС) найбільш гнучкою є односпіральна форма, а найбільш жорсткою – 5’Е топологія чотириспіральної poly(rС).

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Больбух Т.В., м.н.с. Близнюк Ю.М., с.н.с. Гасан А.Й., н.с. Гладковська Н.О., н.с. Духопельников Є.В., с.н.с. Кашпур В.А., с.н.с. Круглова О.Б.,  с.н.с. Малєєв В.Я., с.н.с. Семенов М.О., с.н.с. Шестопалова Г.В., асп. Мірошніченко К.В., асп. Хребтова Г.С.

Анотація виконання річного плану НДР «Спіраль»

Усі отримані результати не мають наукових аналогів в Україні та у світі.

1. Виконано спектрофотометричні дослідження у видимій та УФ- областях взаємодії біологічно активних препаратів: нуклеозиду 6AZC з тимусною ДНК у присутності похідного актиноцинового антибіотика ActII та бромистого етидія (ЕБ) (як конкуруючих лігандів); а також ActII з односпіральною поліадениловою кислотою poly(dA) при різних співвідношеннях концентрацій реагуючих компонентів.

На підставі аналізу кривих титрування сумішей 6AZC – ДНК – ActII та  6AZC – ДНК – ЕБ, які були отримані у видимій області спектру, зроблено висновок, що 6AZC взаємодіє з ДНК за допомогою інтеркаляції і, таким чином, є конкурентом ActII та ЕБ при їх зв’язуванні з ДНК. Показано, що у присутності 6AZC змінюються концентраційні залежності спектрів поглинання ActII та ЕБ з ДНК.

На підставі аналізу кривих титрування сумішей Act II – poly(dA), які були отримані  у видимій області спектру при рН =6,86, зроблено висновок, що Act II взаємодіє з poly(dA) з утворенням як мінімум двох типів комплексів.

За допомогою програм оптимізації DALSMOD проаналізовано різні теоретичні моделі зв’язування та отримані попередні дані про величини термодинамічних параметрів зв’язування Act II з poly(dA)  (К₁~10⁴ М^-1, К₂~10⁵ М^-1) та 6AZC з ДНК (К~10³ М^-1).

Виконавці – с.н.с. Круглова О.Б., м.н.с. Гладковська Н.О., асп. Єрмак Є.Л.

2. За допомогою комп’ютерного моделювання (молекулярний докінг, методи Монте Карло) виконано розрахунки параметрів взаємодії похідного актиноцинового антибіотику ActIII з фрагментами двоспіральної полірибоцитиділової кислоти (poly(rС))

На підставі аналізу результатів молекулярного докінгу та експериментальних даних про комплексоутворення похідного актиноцину (АctIII) та двоспіральної полірибоцитиділової кислоти (poly(rС)) отримано п¢ять структур комплексів АctIII – poly(rC), у яких енергії взаємодії мішень-ліганд мінімальні, а комплекси стабілізуються міжмолекулярними водневими зв¢язками. В утворенні водневих зв¢язків з боку poly(rC) приймають участь групи цитозину та/або атоми кисню сахарофосфатного остову, а з боку АctIII – NH₂, С=О, NH-групи феноксазонового хромофору і бокових аміноалкільних радикалів. За допомогою методу Монте Карло визначено вплив розчинника – молекул води на структуру комплексів, що були отримані за допомогою молекулярного докінгу. Показано, що розчинник має можливість додатково стабілізувати комплекси полінуклеотидної мішені та ліганду за допомогою молекул води, що утворюють „містки” між донорно-акцепторними групами мішені та ліганду. Запропоновано одну з молекулярних моделей як найбільш ймовірну щодо структури комплексу АctIII – poly(rC.)

Виконавці – с.н.с. Шестопалова Г.В., асп. Мірошніченко К.В.

3. Методами Раман спектроскопії та спектрофотометрії у видимій області виконано дослідження комплексоутворення похідного актиноцинового ряду ActIII з двоспіральною poly(rC) у широкому інтервалі значень P/D. Чисельний аналіз спектрофотометричних концентраційних залежностей дозволив встановити інтервали P/D (P – молі фосфату, D – молі ліганду), в яких переважають комплекси з різними типами зв’язування лігандів (мономерно зв’язаний і агрегований) з двоспіральною структурою poly(C). На основі отриманих Раман спектрів комплексів ActIII-poly(C)·poly(C⁺) визначено групи атомів ліганду ActIII, що беруть участь в утворенні комплексів з полінуклеотидною матрицею по типу зовнішнього зв’язування.

Виконавці – с.н.с. Больбух Т.В., м.н.с. Близнюк Ю.М., с.н.с. Круглова О.Б., с.н.с. Семенов М.О.

4. Методами НВЧ діелектрометрії, гель електрофорезу та ІЧ спектроскопії вивчено вплив гамма опромінення на комплекс ДНК – кофеїн. Показано, що комплексоутворення приводить до зміни діелектричних параметрів і дегідратації компонентів – молекул ДНК та кофеїну. Встановлено, що у випадку комплексу радіація не спричиняє, на відміну від опромінення ДНК, руйнування гідратного хребта ДНК і не впливає на ступінь полімерності нативної ДНК. Аналіз результатів встановив, що основні елементи структури ДНК у комплексі зберігаються при впливі радіації. Цей висновок свідчить про захисні властивості кофеїну.

Виконавці – с.н.с. Кашпур В.А., н.с. Хорунжа О.В., с.н.с. Красницька А.А.

5. Виконано комплексне порівняльне дослідження особливостей гідратації та конформаційних переходів наступних колагенових структур: 1) колагену I типу з шкіри теляти фірми Sigma, 2) модельного колаген-подібного політрипептиду poly(Pro-Gly-Pro) фірми Sigma, 3) колагену I типу, мінералізованого in vitro. Мінералізацію колагену проведено з використанням методики, яка дозволяє одночасне формування нанокристалів гідроксиапатиту та фібрилоутворення колагену. Для вивчення особливостей гідратації застосовували ІЧ спектроскопію та п’єзогравіметрію плівок зразків в умовах широкого діапазону значень відносної вологості в атмосфері легкої та важкої води. Виявлено, що для колагенових структур в інтервалі 0-70% відносної вологості є характерним міцне зв’язування 3-4 молекул води на один трипептид -(Gly-Х-Y)-, та одночасне зміцнення міжпептидних водневих зв’язків; ці процеси супроводжуються низькочастотним зсувом смуги поглинання Амід I та високочастотним – смуги Амід II. На основі отриманих експериментальних даних розраховано енергії гідратації колагенових структур та енергиії міжпептидних водневих зв’язків. Мінералізація колагену не призводить до помітних змін спектральних параметрів смуг поглинання Амід I та Амід II.

Проведено розрахунок частотних зсувів валентних коливань СО – груп, до яких призводять динамічні резонансні взаємодії карбонільних коливань атомів в колагенових структурах (Gly-Pro-Hyp)₂-Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg-(Gly-Pro-Hyp)₃ та (Pro-Hyp Gly-)₃-Ile-Thr-Gly-Ala-Arg-Gly-Leu-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)₄ в диполь-дипольному наближенні на підставі теорії молекулярних екситонів. Розраховано спектральні параметри основних компонентів тонкої структури смуги Амід I ІЧ Фур’є спектру природного колагену і зроблено їх віднесення.

Виконавці – м.н.с. Мележик О.П., с.н.с. Больбух Т.В., с.н.с. Семенов М.О.

6. З використанням методики скануючої мікрокалориметрії проведені дослідження впливу пірідоксину (вітамін В₆) на термостабільність вторинної структури ДНК. Показано, що цей ліганд при взаємодії з ДНК призводить до значного зростання, в залежності від концентрації, температури плавлення (Т_пл) та енергії (ΔН_пл) структурного переходу. Причини такої дії пірідоксину з’ясовуються.

Виконавці – с.н.с. Гасан А.Й., м.н.с. Філіпський А.В.

Анотація виконання річного плану НДР «Структура»

Розроблено нову методику оцінки термодинамічних параметрів зв’язування  лігандів з ДНК, що враховують утворення як мінімум двох типів комплексів та різницю в температурних залежностях констант зв’язування лігандів з ДНК. Придатність цієї методики до розрахунку термодинамічних параметрів зв’язування DH, DS, DG та оцінки зміщення температур плавлення сумішей (DT_m) ліганд-ДНК було перевірено на системах похідне актиноцину Асt II з молекулами ДНК різного АТ-, ГЦ- складу, та з молекулами одно- та двоспіральної poly(rC). Також проведено температурні дослідження взаємодії біологічно активного нуклеозиду 6-азацитозіну (6AZC) з нативними та опроміненими молекулами ДНК.

Виконавці – с.н.с. Березняк К.Г., с.н.с. Больбух Т.В., м.н.с. Близнюк Ю.М., с.н.с. Гасан А.Й., м.н.с. Гладковська Н.О., н.с. Духопельников Є.В., с.н.с. Кашпур В.А., с.н.с. Круглова О.Б., с.н.с. Малєєв В.Я., с.н.с. Семенов М.О., с.н.с. Шестопалова Г.В.